Summary: Keď laboratórium získa novú bunkovú líniu, bunková línia sa musí najskôr kultivovať a expandovať a potom zmraziť. Kryokonzerváciu buniek možno najskôr použiť ako zálohu, keď sa bunky stratia v dôsledku znečistenia a iných podmienok. Okre......
Keď laboratórium získa novú bunkovú líniu, bunková línia sa musí najskôr kultivovať a expandovať a potom zmraziť. Kryokonzerváciu buniek možno najskôr použiť ako zálohu, keď sa bunky stratia v dôsledku znečistenia a iných podmienok. Okrem toho takmer všetky bunky podliehajú určitému stupňu variácií počas procesu kultivácie a pasážovania. Aby sa zachovala konzistentnosť experimentálnych výsledkov, bunky sa vo všeobecnosti nemôžu kultivovať desiatky generácií. Ak sa použije znova, je potrebné pred použitím rozmraziť a kultivovať kryokonzervované, menej pasážované bunky.
Proces zmrazovania buniek má štyri hlavné body: zber buniek, použitie ochranných prostriedkov, rýchlosť zmrazovania a skladovacie prostredie.
Bunkový zber
Bunky použité na kryokonzerváciu sa vo všeobecnosti vyberú, keď sú bunky približne z 90 % konfluentné. V tomto čase je rast buniek dobrý a počet buniek je veľký a kultivačné médium by sa malo vymeniť 24 hodín pred zberom buniek. Spôsob zberu buniek na kryokonzerváciu je rovnaký ako obvykle. Centrifugujte pri 100 x g počas 5 minút, aby ste zhromaždili bunky a resuspendovali ich. Živé bunky sa spočítajú. Zrieďte alebo koncentrujte na dvojnásobok konečnej koncentrácie buniek na uchovanie buniek (zvyčajne 4 – 10 miliónov buniek/ml), pridajte rovnaký objem pripraveného roztoku zmesi ochranného činidla kultivačného média a jemne premiešajte a alikvotnú časť vložte do skúmavky na kryokonzerváciu, kryoprezervácia.
Použitie ochranných prostriedkov.
Pri kryokonzervácii buniek sa DMSO všeobecne používa ako ochranný prostriedok. Pri kryokonzervácii buniek je konečná koncentrácia použitého DMSO vo všeobecnosti 5 až 15 %. Koncentráciu DMSO v kryokonzervačnom roztoku konkrétnej bunky možno nájsť z ATCC. Pre obzvlášť citlivé bunky, najmä hybridómové bunky, môže byť pri kryoprezervácii lepšie použiť 95 % sérum a 5 % DMSO. Pri použití ochranného činidla použite kultivačné médium alebo sérum na vytvorenie dvojnásobnej konečnej koncentrácie a potom ich zmiešajte s rovnakým objemom suspenzného bunkového kultivačného média. Rýchlosť zmrazovania buniek
Rýchlosť zmrazovania buniek sa najlepšie kontroluje, aby sa bunkám poskytol dostatočný čas na dehydratáciu bez toho, aby boli poškodené nadmernou dehydratáciou. Pre väčšinu buniek je vhodný pokles teploty o 1 až 3 °C za minútu. Zvyčajná operácia spočíva v tom, že sa bunky umiestnia na -20 °C na 1-2 hodiny, potom sa vložia na noc do chladničky -80 °C (ak nie je chladnička na -80 °C, môžete použiť suchý ľad) a potom preneste do nádrže na tekutý dusík alebo pod -130 Dlhodobé skladovanie v chladničke pri ℃.
Skladovacie prostredie
Teplota dlhodobého skladovania článkov je -130 ℃ alebo nižšia. Teplota plynnej vrstvy v nádrži s tekutým dusíkom je medzi -140 ℃ a -180 ℃. Bunky môžu byť uložené v plynnej vrstve alebo ponorené do tekutého dusíka. Ak je to možné, najlepšie je skladovať v plynnej vrstve, pretože môže zabrániť vniknutiu tekutého dusíka do mraziaceho skladu. Rúrka spôsobí výbuch pri vybratí článkov (takto sa však v nádrži na tekutý dusík dá uložiť len malé množstvo tekutého dusíka, ktorý je potrebné často dopĺňať). Bunky môžu byť tiež skladované v chladničke pri -80 ° C počas niekoľkých mesiacov.
英语
阿拉伯语
������