1. Bunky, ktoré sa majú kryokonzervovať, by mali byť v stave dobrého rastu (log fáza) a vysokej miery prežitia, s hustotou asi 80-90 %.
2. Pred zmrazením skontrolujte, či si bunky stále zachovávajú svoje jedinečné vlastnosti.
Napríklad hybridóm by sa mal testovať na produkciu protilátok jeden až dva dni pred kryokonzerváciou.
3. Dbajte na kvalitu kryoprotektantu.
DMSO by mal byť reagenčnej kvality, sterilný a bezfarebný (filtrovaný 0,22 mikrónovým FGLP Telflon alebo priamo zakúpenými sterilnými produktmi, ako je Sigma D-2650), rozdelený na alikvóty v malých objemoch 5-10 ml, skladovaný pri 4 oC v tme. Nerozmrazujte viackrát. Glycerol by mal byť tiež v čistote pre činidlo a po autoklávovaní by mal byť skladovaný v tme. Po otvorení spotrebujte do jedného roka, pretože po dlhodobom skladovaní bude pre bunky toxický.
4. Koncentrácia buniek na kryokonzerváciu:
(1) Normálny ľudský fibroblast: 1~3 x 106 buniek/ml
(2) Hybridóm: 1~3 x 106 buniek/ml, koncentrácia buniek by nemala byť príliš vysoká, niektoré hybridómy odumrú po rozmrazení 24 hodín v dôsledku vysokej koncentrácie zmrazenia.
(3) Adherentné nádorové línie: 5~7 x 106, v závislosti od typu bunky. Adenokarcinóm vyžaduje vyššiu koncentráciu po rozmrazení, kým HeLa potrebuje len 1-3 x 106 buniek/ml.
(4) iné suspenzie: 5~10 x 106 buniek/ml, ľudský lymfocyt musí byť aspoň 5 x 106 buniek/ml.
5. Koncentrácia kryoprotektantu je 5 alebo 10 % DMSO. Ak sú podmienky zmrazenia buniek neisté, počas kryokonzervácie by sa mala použiť záložná kultúra, aby sa zabránilo zlyhaniu zmrazenia.
6. Spôsob zmrazovania:
(1) Tradičná metóda: 4 oC 10 minút ---> -20 oC 30 minút ---> -80 oC 16-18 hodín (alebo cez noc) ---> Dlhodobé skladovanie v parnej fáze nádrže s tekutým dusíkom .
(2) Programové chladenie: Použite chladiaci stroj s konštantnou rýchlosťou na zníženie z izbovej teploty na -120 oC rýchlosťou -1 ~ -3 oC/min a uskladnite ho v parnej fáze v nádrži s tekutým dusíkom na dlhú dobu. termínované skladovanie. Je vhodný na konzerváciu suspenzných buniek a hybridómov.
7. Materiál:
(1) Kultivované bunky, ktoré dobre rastú
(2) Čerstvé médium
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Sterilná plastová skúmavka na kryokonzerváciu (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4 % w/v trypánová modrá (GibcoBRL 15250-061)
(6) Doska hemocytometra a krycie sklo
(7) Chladiaci stroj s konštantnou rýchlosťou (KRYO 10 Series II)
8. Kroky:
(1) Jeden deň pred zmrazením vymeňte polovicu alebo celé množstvo média a sledujte rast buniek.
(2) Príprava kryokonzervačného roztoku (príprava pred použitím): Pridajte DMSO do čerstvého média, konečná koncentrácia je 5-10 %, dobre premiešajte a dajte pri izbovej teplote na neskoršie použitie.
(3) Podľa spôsobu fungovania bunkovej subkultúry odoberte kultivované bunky a odoberte malé množstvo bunkovej suspenzie (asi 0,1 ml), aby ste pred zmrazením vypočítali koncentráciu buniek a mieru prežitia.
(4) Odstreďte, odstráňte supernatant, pridajte vhodné množstvo roztoku na kryokonzerváciu, aby bola koncentrácia buniek 1-5 x 106 buniek/ml, dobre premiešajte a nadávkujte do označenej skúmavky na kryokonzerváciu, 1 ml/ampulu a odoberte malú množstvo bunkovej suspenzie na detekciu kontaminácie.
(5) Metóda kryokonzervácie 1: Kryoskúmavka sa umiestni pri teplote 4 oC na 10 minút → -20 oC na 30 minút → -80 oC na 16 až 18 hodín (alebo cez noc) → parná fáza nádrže s tekutým dusíkom na dlhodobé skladovanie.
(6) Spôsob skladovania zmrazením 2: Zmrazovacia trubica sa umiestni do chladiaceho stroja s konštantnou rýchlosťou s nastaveným programom a potom sa umiestni do nádrže na tekutý dusík.
英语
阿拉伯语
������